流式細胞術(shù)檢測時的樣品制備方法

  （一）直接免疫熒光標記法
  取一定量細胞（約1X106細胞／ml），在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上（）,再直接加入連接有熒光素的抗體進行免疫標記反應(yīng)（如做雙標或多標染色，可把幾種標記有不同熒光素的抗體同時加入），。孵育20-60分鐘后，用PBS（pH7．2—7．4）洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機檢測。本方法操作簡便，結(jié)果準確，易于分析，適用于同一細胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標抗體試劑成本較高，但減少了間接標記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標本的檢測。
  （二）間接免疫熒光標記法
  取一定量的細胞懸液（約1X106細胞／ml），先加入特異的*抗體，待反應(yīng)*后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復合物，以FCM檢測其上標記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研標本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結(jié)果。所以標本制備時應(yīng)加入陰性或陽性對照。另外，由于間標法步驟較多，增加了細胞的丟失，不適用測定細胞數(shù)較少的標本。
二、zui小化非特異性結(jié)合的方法
1．熒光標記的抗體的濃度應(yīng)該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。
2．在使用*抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標記的第二抗體。這個步驟通過阻斷*抗體和細胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來降低背景。
3．在使用*抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與*抗體、細胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它也會導致已標記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復合體的形成。這種復合體會優(yōu)先與一些細胞結(jié)構(gòu)進行結(jié)合，或者它們zui終會導致期望得到的抗體活性的丟失。
4．使用F（ab’）2片段會使背景決定于*或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F（ab’）2片段容易利用。而*抗體的F（ab’）2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入*抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。
5．其它：已標記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會有背景影響。為了降低背景，在多重標記過程中，所有的已標記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng)。