流式細胞儀標本的制備

流式細胞儀（FCM）是八十年代集單克隆抗體、熒光化學、激光、計算機等高技術發(fā)展起來的一種先進儀器，已廣泛應用于免疫學、生物化學、生物學、腫瘤學以及血液學等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標志可對白血病、淋巴瘤作用迅速正確的診斷，對淋巴細胞群和亞群進行分類，還能分離純化某一群或亞群細胞。活細胞免疫熒光技術是用于FCM檢測的標本準備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞免疫熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接免疫熒光的
結果。
　　（一）　原理
　　活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應抗原結合，再用熒光標記的第二抗體結合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應抗原的密度和分布。
　　（二）　操作步驟
　　　　　制備活性高的細胞懸液（培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、
　　　　　胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法）
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　用10％FCS　RPMI1640調整細胞濃度為
　　　　　　　　　5×10６～１×10７／ml
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　取40μl細胞懸液加入預先有特異性McAb（5～50μl）
　　　　　　　　的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20（用DPBS
　　　　　　　　稀釋）滅活正常兔血清
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓4℃ 30min
　　　　　　　　用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠
　　　　　　　　　（或兔抗鼠）熒光標記物，充分振搖
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓　4℃ 30min
　　　　　　　　　用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右
　　　　　　　　　　　　　　1000rpm×5min
　　　　　　　　　　　　　　　　　↓
　　　　　　　　　加適量固定液（如為FCM制備標本，一般加入
　　　　　　　　　1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，
　　　　　　　　　視細胞濃度加入100～500μl固定液）
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　　　　　　　　　FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察
　　　　　　　　　　（標本在試管中可保存5～7天）

　　（三）　試劑和器材
　　1.　各種特異性單克隆抗體。
　　2.　熒光標記的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗體，滅活正常兔血清。
　　3.　10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液（見附錄）。
　　4.　玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。
　　（四）　注意事項
　　1.　整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。
　　2.　洗滌要充分，以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結合，出現(xiàn)假陰性。
　　3.　加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面免疫球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。
　　4.　細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。
　　附:
　　1. DPBS （×10, 貯存液）
　　　　NaCl 80g
　　　　KCl 2g 　　　　　蒸餾水加至1000ml
　　　　Na２HPO４ 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋
　　　　KH２PO４ 2g
　　2.　洗滌液
　　　　DPBS　　　　　　900ml
　　　　FCS 50ml （終濃度　5％）
　　　　4％NaN３　　　50ml （終濃度0.2％）
　　3.　固定液
　　　　DPBS　　　　1000ml
　　　　葡萄糖　　　　20g （終濃度2％）
　　　　甲　醛　　　　10ml
　　　　NaN３　　　0.2g （終濃度0.02％）