淋巴組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原流式檢測(cè)步驟

淋巴組織細(xì)胞或培養(yǎng)細(xì)胞表面抗原流式檢測(cè)步驟 
（一）細(xì)胞樣品準(zhǔn)備 
收集組織或細(xì)胞 
1. 取出目的組織（如:脾臟、淋巴結(jié)、胸腺、骨髓等），迅速浸泡在 Cell Staining Buffer 
(BioLegend Cat. #420201)中，并應(yīng)用研磨及過(guò)濾等方法制備成單細(xì)胞懸液；如果為體外
培養(yǎng)細(xì)胞，直接用 Cell Staining Buffer 重懸細(xì)胞后進(jìn)行下一步操作。 
2. 添加 Cell Staining Buffer 至約15mL，離心（350 x g）5分鐘后棄去上清液。 
裂解紅細(xì)胞（脾臟組織等） 
3. 如樣品為脾臟組織細(xì)胞，需要裂解紅細(xì)胞。把10X 紅細(xì)胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) 
(BioLegend Cat. #420301)  用去離子水稀釋成 1X工作液。然后用3 ml 紅細(xì)胞裂解工作
液重懸細(xì)胞后，在冰上孵育 5分鐘。 
4. 加入 10 ml Cell Staining Buffer 到管中；離心（350 x g）5分鐘后棄去上清液。 
5. 重復(fù)洗滌細(xì)胞一次（步驟2）。 
6. 用 Cell Staining Buffer 重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞為 5-10 x 106 細(xì)胞/ml，然后每支流
式檢測(cè)管中加入100uL細(xì)胞懸液（5-10 x 105 細(xì)胞/管）。 
Fc受體封閉（可選） 
7. Fc受體的封閉過(guò)程是為了減少抗體的非特異性結(jié)合造成的影響；對(duì)于小鼠細(xì)胞的檢測(cè)，
BioLegend 公司的純化抗小鼠  CD16/CD32 抗體特異識(shí)別并結(jié)合 Fcγ R III/II (Cat. 
#101302, clone 93)，適用于封閉抗體非特異染色；實(shí)驗(yàn)操作為用 5-10 μg/ml 純化CD16/32
抗體與細(xì)胞冰上孵育 10分鐘。而對(duì)于市面上沒(méi)有可用的人或大鼠封閉抗體，可以采用
加入無(wú)關(guān)純化免疫球蛋白（如與所用熒光標(biāo)記抗體相同種屬和抗體亞型）到細(xì)胞樣品中
進(jìn)行封閉。 
（二）細(xì)胞表面熒光染色步驟 
8. 在每個(gè)流式檢測(cè)管中加入適量的預(yù)稀釋好的一抗（熒光標(biāo)記抗體、生物標(biāo)記抗體或純
化抗體）；在空白管/孔或同型對(duì)照管/孔中加入與抗體相同量的對(duì)照試劑。然后各管避
光冰浴或在4℃冰箱中孵育 15-20分鐘。（注：有些抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間，建
議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索） 
9. 加入至少 2mL Cell Staining Buffer，然后 350g離心5分鐘后棄去上清液；重復(fù)洗滌過(guò)
程兩次。 
10.（間接標(biāo)記）若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體，則每管/孔加入適量稀釋好的
熒光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后于冰浴或在4℃
冰箱中避光孵育15-20 分鐘。 
11. 重復(fù)洗滌細(xì)胞一次（按步驟 9）。 
12. 用 0.5 ml Cell Staining Buffer  重懸細(xì)胞；如有必要，加入 10uL(0.25 μg)/million 細(xì)胞
的核染料7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以區(qū)分活、死細(xì)胞，冰上孵育3-5 分鐘。（注：
我們不建議7-AAD與 PE-Cy5  或  PE-Cy7 等熒光標(biāo)記抗體聯(lián)用）13.上機(jī)檢測(cè)并分析結(jié)
果。 
B．全血細(xì)胞表面抗原的流式檢測(cè)步驟 
1.往含有100uL 抗凝全血的流式檢測(cè)管中加入適量的預(yù)稀釋好的一抗（熒光標(biāo)記抗體、
生物標(biāo)記抗體或純化抗體）。 
2. 室溫避光孵育15-20分鐘。（注：有些結(jié)合能力較低的抗體可能需要更長(zhǎng)的孵育時(shí)間，
建議實(shí)驗(yàn)者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)摸索） 
3.把10X  紅細(xì)胞裂解液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301)  用去離子水稀釋
成1X工作液，用之前恢復(fù)至室溫。加入2 ml  紅細(xì)胞裂解工作液到含全血/一抗的檢測(cè) 
 
管中，室溫孵育10分鐘。 
4.350g離心 5分鐘后棄去上清液。 
5.加入至少2mL Cell Staining Buffer，然后 350g離心5分鐘后棄去上清液。 
6.（間接標(biāo)記）若使用的一抗是純化或生物素標(biāo)記抗體，則每管/孔加入適量稀釋好的熒
光標(biāo)記二抗或熒光標(biāo)記親和素（SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204）后室溫避光孵育15-20
分鐘。 
7.重復(fù)洗滌細(xì)胞一次（按步驟 5）。 
8.用500ul Staining Buffer 或 500ul 2%的多聚甲醛固定液重懸細(xì)胞。 
9.上機(jī)檢測(cè)并分析結(jié)果。